随着WGBS研究的深入，研究人员对有关数据质量的聚合酶也提出了更高的要求。接着将KAPAU放在高背景下进行分析，将GC均匀性细分为G和C两种碱基，结果表明，G碱基的情况下，在众多聚合酶中KAPA  U是较均匀的，但C碱基出现了明显的偏向。那么，真相到底是不是这样呢?

　　事实上，如果从WGBS数据中联想到高甲基化碎片(C含量高)被过度排序，CpG区域覆盖率低的现象，那么很容易看出所有线索都是C碱基的覆盖率有问题。如果不拘泥于PCR过程，很容易想起真正的元凶。那就是Bisulfite。

　　研究表明，在Bisulfite的DNA转换过程中，甲基化修饰使C(5mC)更稳定、更不容易断裂，未修饰的C碱更容易破坏(图8 A)。根据这一原理，解决了传统Pre-BS WGBS数据的许多疑惑，在Bisulfite处理过程中，C含量高的CpG岛地区的覆盖率急剧下降，AT-rich的片段被过度排序，而Post-BS  WGBS与项低的KAPAU一起使用，想想也觉得对聚合酶很委屈。事实上，我们被BISULFITT破坏了，正在放大不再存在的碎片。但是，Post-BS对聚合酶算是公平的。当然，偏好的原因很复杂，受Bisulfite转换效率、甲基化状态等影响。

　　排序数据偏好对NGS来说是缓慢的烟雾。特别是NGS生产力每次运行都能吐出TB级数据的时候，如果稍不注意，排序方法偏好高，就可以丢弃大量数据。因此，深入探索这种偏好的原因是对研究的责任，更有利于产业的长期健康发展。

　　WGBS是NGS的几个灾区之一，造成甲基化测序偏好的主要因素有两个。一是浓缩众所周知的文库部时使用的PCR技术，二是Bisulfite分解偏好。这个发现很有趣。聚丙烯是他长期的“锅”。

　　首先，我们来看一下PCR偏好。俗话说，聚合酶再好的文库也出不来。(PCR-free忽略小偏题)，聚合酶有两点很重要。一是序列增强偏好，二是增强 效率，甲基化碱基序列分析还需要增加一个。这是关于含有dU碱模板的增强 效率。

　　在全球研究人员的长期实测中，Kapahifiborasil和Pfu Turbo Cx两种聚合酶引人注目;其中KAPA  HiFi  Uracil(后药型KAPA U)聚合酶的GC偏好较低，对U扩增效率也很理想，100ng投入量可以保证WGBS文库在4个周期内达到测序要求。就连Illumina也客观地推荐了自己的甲基化捕获试剂盒中的KAPA、HiFi、Uracil。