简化基因组甲基化测序 (RRBS)

项目介绍

参数

常见问题

应用案例

RRBS最高性价比甲基化检测方案

简化甲基化测序（Reduced Representation Bisulfite Sequencing，RRBS），

通过酶切富集启动子及CpG 岛区域，并进行Bisulfite 测序；

作为最高性价比的甲基化研究方法，RRBS在大规模临床样本的研究中具有广泛的应用；

在经典RRBS基础上，艾斯基因在国内首家推出强化版 RRBS，助力全基因组甲基化测序，

可覆盖全基因组范围内超过6-9M个CpG 位点，>90%数量的CpG岛及>85%数量的基因启动子。

核心技术质控，用心服务每一个项目

艾斯团队专注表观组学10年，提供专业有价值的DNA甲基化完整解决方案；

最早开发RRBS技术团队之一, 国内首家推出强化版RRBS服务；

已经完成人、哺乳动物及鱼类等多个物种, 10000+例样本项目经验;

严格的RRBS技术质控，MSPI酶切率>95%, Bisulfite转化率>99%;

自动化样本处理、建库及分析流程，保障高效周期，40天极速交付;

低至10ng建库，满足穿刺、流式分选、微切等微量珍贵样本的研究；

核心团队在Nature、Epigenetics、DNA Res等杂志发表多篇SCI论文；

专业的生物信息分析团队, 提供更多个性化分析思路和方案。

科学方案设计

从项目方案、样本处理、建库测序，到数据分析；

每个项目需要专业、有价值的建议；及时高效的沟通，以保障高质量研究成果。

样本类型和要求

样本类型	样本要求
基因组DNA	总量≥ 1ug; 浓度≥ 30ng/ul; 完整性好; 基于Qubit定量
细胞、全血、动物新鲜冷冻组织	按照送样要求准备
备注1：不推荐FFPE、cfDNA等片段化样本类型；备注2：不适合植物物种；
备注2：用封口膜密封样品; 干冰运输

数据分析

RRBS	分析内容	备注
标准分析	1、测序数据质量评估	过滤掉低质量数据，保证数据质量
	2、与参考基因组比对	比对率和覆盖度分析
	3、MSPI酶切及Bisulfite转化率质控	MSPI酶切效率>95%; Bisulfite转化率>99%
	4、甲基化位点Calling	评估胞嘧啶甲基化状态
	5、甲基化分布图谱分析	甲基化在基因组、功能元件上的分布
	6、组间差异甲基化DMR分析	寻找DMR及注释
	7、差异甲基化基因DMG分析	DMG富集分析GO，KEGG
	8、多样本聚类分析	PCA分析多样本甲基化变化规律
高级分析	9、多组学整合关联分析	例如与转录组关联分析
高级分析	10、其它定制化分析	结合课题背景亮点挖掘

Q1：为什么RRBS是人和哺乳动物全基因组甲基化研究的首选方案？

RRBS 用MspI 酶切将CpG 位点富集出来进行测序，人和哺乳动物基因组DNA甲基化主要发生在CpG二核苷酸的胞嘧啶上；因此，RRBS是研究基因组CpG甲基化性价比最高的方案，检测单碱基分辨率的高CG区域，仅需少量的DNA样本和较低的成本而被广泛使用。目前RRBS主要用于人、大小鼠、猴、猪、牛等哺乳动物，也常用于其他动物、鸟类及鱼类等物种。

下图是经典的人和哺乳动物基因组甲基化特征：

1、具有CpG岛的基因启动子区域，通常处于低甲基化状态，基因间区、重复序列等非冗余区域，通常处于高甲基化状态。

2、CpG岛常位于基因转录调控区附近(启动子和第一外显子区域), 与60%的基因组编码基因相关;

3、人类基因组有约56M的CpG位点，CpG岛约4.5万个, CpG岛的数目与基因密度有良好的对应关系。

Q2：为什么MSPI酶切率对于RRBS测序质控至关重要？

除了类似WGBS对Bisufite转化率>99%最基本的质控，RRBS还需要做好MSPI酶切富集的一致性等重要质控，而RRBS覆盖有效深度及重叠比例与MSPI酶切率密切相关；通常MSPI酶切率要求不低于95%，最好能够达到99%。如下图所示，艾斯基因通过严格的质控，目前可以至少保证不低于95%的MSPI酶切率，以满足临床大样本及队列研究对甲基化测序技术高标准要求

Q3：为什么推荐强化版RRBS测序，比经典RRBS的优势如何？

与经典RRBS比较，强化RRBS主要是增加测序量及酶切片段宽度，以便获得更多CpG位点甲基化信息；经典RRBS酶切片段偏小40-220bp，适用于早期的NGS测序read读度，一般为PE50/100，例如Hiseq2000等测序仪；而强化版RRBS提高酶切片段100-350bp，更适应目前主流测序平台PE150测序，可以获得更多的甲基化信息。

艾斯基因在国内率先开发和推广了强化版RRBS测序服务，其与经典RRBS的技术指标比较如下图所示：

Q4：WGBS、RRBS和850K芯片在检测覆盖基因组范围和准确性上的选择？

人和哺乳动物DNA甲基化修饰发生在CpG位点上，人基因组包含约56M总CpG位点, 集中分布在CpG岛、基因启动子、增强子等甲基化调控重要的基因元件上，同时散在分布在非CpG岛、基因间区、异染色质区域等。

技术上，WGBS、RRBS和850K在检测这些CpG位点的覆盖、偏向性和准确性有差异，如下表所示

WGBS：类似突变检测的WGS(重测序)，由于WGBS比对率较低和文库冗余比例较高，实际覆盖基因组范围在70%左右，有效覆盖深度为15-20X。

RRBS：类似突变检测的WES(全外显子测序)，是研究基因组CpG甲基化性价比最高的方案，国内外甲基化测序服务商(Zymo Research及艾斯基因)相继推出强化版RRBS测序，可以显著增加基因组CG位点数量的覆盖，尤其在增强子、CGI shore等核心区域，强化版RRBS可以覆盖6-10M左右的CpG位点，占人基因组56M总CpG位点的15%；同时有效测序深度可达50-100X，比WGBS高出很多，因此甲基化检测准确性更高；

850K芯片：基于甲基化分析平台MethylationEPIC 850K BeadChip(450K芯片的增强版), 采用Oligo nucleotide杂交技术，芯片的批次效应（batch effect）有时会较严重，信噪比较差(来自徐瑞华主编的《肿瘤学》第五版p73-74)。850K芯片覆盖的CpG位点主要在CpG岛、启动子及增强子等区域，设计覆盖0.85M左右的CpG位点，占人基因组56M总CpG位点的1.5%左右；450K /850K芯片在早期人基因组甲基化研究中发挥了重要作用，其主要原因是WGBS和RRBS在早期测序平台上的价格昂贵，无法满足临床样本全基因组甲基化研究。但随着WGBS和RRBS测序成本下降，甲基化850K芯片的应用越来越少。

综上，从这3种技术检测基因组CpG覆盖范围, 依次为WGBS > RRBS > 850K芯片；甲基化检测准确性是由测序深度决定的, 依次为RRBS > WGBS > 850K芯片。

Q5：WGBS、RRBS和850K芯片在不同甲基化研究课题中的推荐指数？

针对不同的甲基化研究课题需求，选择合适的技术方案！同时考虑技术的先进性、成本及研究的主要目的，对大型队列研究、临床样本(库)及细胞系模型等研究方向，不同的推荐，如下图所示：