全基因组甲基化测序（WGBS）_深圳市艾斯基因科技有限公司

WGBS甲基化检测最有力的方案

全基因组甲基化测序(Whole Genome Bisulfite Sequencing, WGBS)，

是结合重亚硫酸盐Bisulfite处理和NGS高通量测序技术，

对有参考基因组的物种在全基因组水平进行单碱基分辨率的甲基化检测，

适合各种类型的样本(细胞、全血、组织、病理切片、血浆cfDNA等)

广泛用于人、动物及农林牧渔等方向的高水平甲基化研究。

用心服务每一个项目

艾斯团队专注表观组学10年，提供专业有价值的DNA甲基化完整解决方案；

已经完成人、动植物等几十个物种, 5000+例样本WGBS项目经验；

已完成常规样本、复杂样本（FFPE）及微量样本（血浆cfDNA）多种样本类型项目；

严格WGBS建库质控和效率，Bisulfite转化率>99%;

自动化建库测序流程，保障WGBS周期交付能力；

核心团队发表Genome Biol、Nat Commun、Cell Res等高水平SCI文章；

专业的生物信息分析团队, 提供更多个性化分析思路和方案。

科学方案设计

从项目方案、样本处理、建库测序，到数据分析；

每个项目需要专业、有价值的建议；及时高效的沟通，以保障高质量研究成果

样本类型和要求

样本类型	样本要求
基因组DNA	总量≥ 3ug; 浓度≥ 30ng/ul; 基于Qubit定量
血浆/血清/cfDNA	建议提供1-4ml血浆/血清, 或者>15ng cfDNA
细胞、全血、动植物组织等	按照送样要求准备
备注：用封口膜密封样品; 干冰运输

信息分析

WGBS	分析内容	备注
标准分析	1、测序数据质量评估	过滤掉低质量数据，保证数据质量
	2、与参考基因组比对	比对率和覆盖度分析
	3、甲基化位点Calling	评估胞嘧啶甲基化状态
	4、甲基化分布图谱分析	甲基化在基因组、功能元件上的分布
	5、组间差异甲基化DMR分析	寻找DMR及注释
	6、差异甲基化基因DMG分析	DMG富集分析GO，KEGG
	7、多样本聚类分析	PCA分析多样本甲基化变化规律
高级分析	8、多组学整合关联分析	例如与转录组关联分析
高级分析	9、其它定制化分析	结合课题背景亮点挖掘

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Q1：哪些物种可以研究WGBS?

具有参考基因组的人、模式生物、其它动植物、藻类、真核生物等；至少拼接到scaffold水平, 具有较为完整的注释。

Q2：WGBS主要的技术质控？

一般通过加入没有甲基化化修饰的lambda DNA质控Bisulfite的转化率，要求转化率>99%.

Q3：WGBS具有哪些优势？

WGBS的优势主要是体现在技术层面上：

1、不仅能够高精度发现CpG岛等常见区域的甲基化水平的变化，还能够分析gene body区，基因间区等区域的甲基化水平的差异，因此，技术上WGBS是研究甲基化最有力的方案;

2、适用于动植物所有有参基因组物种及几乎所有样本类型，例如细胞、全血、新鲜冷冻组织、病理FFPE、cfDNA等临床样本等；

Q4：WGBS具有哪些劣势？

WGBS的劣势主要是体现在应用层面上——成本最高！

由于WGBS推荐测序深度>30X基因组，成本与基因组大小成正比, 因此在不同的应用领域，主要是考虑成本费用因素：

1、对于小基因组物种, 例如大豆、水稻等油粮作物、绝大多数蔬菜水果等植物物种(基因组大小<1.5G), WGBS是非常合适也是唯一的金标准检测方案; 应用上，广泛用于经济植物遗传育种、生理病理机制研究等；

2、对于人和哺乳动物大基因组样本(基因组大小在2-3G)，WGBS的测序成本非常高，制约了其应用；同时除了WGBS方案，人和动物样本还可以选择最高性价比的RRBS方案及甲基化芯片(例如850K芯片，仅限于人样本)：

在临床样本甲基化研究中，由于临床样本异质性较大，课题设计需要检测的样本数量要求较多，一般10-30个样本/分组，WGBS检测成本大大制约了其在临床科研中的应用；

在大型队列研究中，虽然WGBS是终级方案，但也受制于陈本制约，很难检测较多样本；

在模式动物机制研究中，一般3-5个样本/分组，由于课题设计需要检测的样本数量较少，整个课题成本相对可以接受。

如下图所示，WGBS应用方向及推荐指数：

除了成本制约因素，临床样本检测需要更为准确的甲基化检测方案

甲基化检测的准确性由测序深度决定的，依次为RRBS > WGBS > 850K芯片。

WGBS：类似突变检测的WGS(重测序)，由于WGBS比对率较低和文库冗余比例较高，实际覆盖基因组范围在70%左右，有效覆盖深度为15-20X。

RRBS：是研究基因组CpG甲基化性价比最高的方案，检测单碱基分辨率的高CG区域，仅需少量的DNA样本和较低的成本而被广泛使用。RRBS类似突变检测的WES(全外显子测序)，有效测序深度达到50-100X，比WGBS高出很多，因此甲基化检测准确性更高；

850K芯片：基于甲基化分析平台MethylationEPIC 850K BeadChip, 采用Oligo nucleotide杂交技术，芯片的批次效应（batch effect）有时会较严重，信噪比较差(来自徐瑞华主编的《肿瘤学》第五版p73-74)。850K芯片的准确性最低，覆盖基因组CpG位点最少，但是快速便宜，因此在早期EWAS甲基化研究中是非常不错的选择; 但随着WGBS和RRBS测序成本下降，甲基化850K芯片的应用越来越少。

案例分析1: 灵长类早期着床前胚胎发育DNA甲基化重编程(团队成员发表)

De novo DNA methylation during monkey pre-implantation embryogenesis. Cell Research. 2017;27:526-539.

一、研究方案：灵长类胚胎发生的关键表观遗传调控需要DNA甲基化重编程，我们首先建立了基于转座酶的超微量WGBS测序技术，详细研究了猕猴早期着床前胚胎7个阶段(Sperm、Oocytes、Zygotes、2-cell、8-cell、Morula和ICM)的DNA甲基化动态变化过程。

二、研究结果：首次全面阐明了DNA甲基化动力学的“盈与亏”阶段特征，并通过DNA甲基转移酶功能缺失实验表明DNA甲基化影响早期猴胚胎发育。